本路線提供屯門三聖、安定、友愛、屯門市中心、新墟、景峰花園、兆康苑、嶺南大學及富泰往來上水（港鐵上水站、石湖墟、天平）及粉嶺（皇府山、聯和墟、祥華）的巴士服務，於2000年6月4日起投入服務，然而本路線的誕生，可追溯到臨時路線60P （屯門市中心至上水）及假日特別路線261R（屯門市中心至上水，途經藍地及洪水橋）。

1994年至1999年間，屯門公路及青山公路沿途曾多次發生嚴重交通意外與山泥傾瀉，每次皆導致屯門與荃灣間之交通近乎癱瘓（尤其1995年8月16日，屯門公路發生巨石壓死人意外，加上其後颱風「肯特」襲港，屯門公路往九龍方向封閉近兩星期，以便進行斜坡維修。屯門公路需全線封閉後引致新界西北交通大癱瘓，電視台甚至派人現場報導由荃灣用超過1小時步行入屯門的情況）。當年九巴在上述情況出現之時，例必開辦臨時路線60P，來往屯門市中心及上水，使屯門區乘客能在上水火車站轉乘九廣東鐵（現稱港鐵東鐵線），為乘客提供另一條來往市區之路徑。後來開辦的261R線及由該線演變而成的261線（即本路線），可說是以此為雛形。

另一方面，屯門公路在二十世紀九十年代逐漸超出負荷，當局雖然早已落實擴闊屯門公路，三號幹線（郊野公園段）（即青朗公路及大欖隧道）工程亦正如火如荼，但擠塞問題逼在眉睫，必須推出短期措施以解燃眉之急。運輸署因而於1995年12月公開招標承投一條往返屯門碼頭及上水火車站的專線小巴路線（與另外兩條分別往返大興花園至屯門市中心的區內線、及兆康苑至灣仔的通宵過海線並列一組承投），冀望方便乘客接駁渡輪，作為屯門公路大欖段爬山線建成前的紓緩措施。該專線小巴路線由小巴大王馬亞木旗下「運泰實業」投得，編號為44，於1997年1月13日起投入服務。

專線小巴44線投入服務後，客量一直上升，一直客似雲來，加上港人往返中港兩地日益頻繁，而44線小巴具備接駁往返各陸路口岸（當時只有羅湖口岸）交通工具之功能，客量自然急升；該路線不斷加強服務，更須分拆路線（44A、44B、44B1）分流往返屯門不同地點以及落馬洲（新田皇巴站）的乘客。44系列小巴服務仍是供不應求，中途候車乘客久候逾半句鐘才能登車之情形實屬家常便飯。

九巴目睹來往屯門及北區的乘客增幅如此驚人，大跌眼鏡之餘，也密謀加入市場，意圖盡早分一杯羹，在《1998-1999年度巴士路線發展計劃》中，提出開辦往返屯門和上水的假日巴士服務。該路線以261R線為編號，往返上水和屯門市中心，最終於1999年2月14日投入服務，取道洪水橋、藍地、嶺南學院（即嶺南大學）、景峰花園、新墟及置樂花園。不過當時以假日旅遊路線水平收費，全程達$16.80，因此客量一直偏低，未能有效分流44線專線小巴的龐大客流。

與此同時，專線小巴44系服務質素亦為人詬病，超速及拒載等時有發生（主要投訴包括有中途站乘客投訴登車困難、車長往往在客滿的情況下不依指定路線行駛、以及拒載屯門區內的短途客。更甚者，部份車長經常超速駕駛，上水前往虎地甚至更遠的車程竟然需時少於15分鐘，時速達到120公里以上，導致不時發生嚴重交通意外），署方在261R線開辦後不久，即與九巴商討將之改為每日行走的261線（即本路線），並將票價由$16.80減至$10.00。惟此建議招來該系列小巴營辦商「運泰實業」反對，認為當局眼見客量高企即引入專營巴士作競爭，有過橋抽板之嫌，而且261線建議票價低於小巴票價（當時為$13.00），擔心客源會被掠奪。經討價還價後，有關方面將本路線票價定於$12.00之水平，同時有關方面從議員提出的四條定線，擇定可減少與專線小巴44線重疊的方案，最終方案為屯門區內取道安定、友愛、屯門市中心、景峰花園、嶺南大學及富泰。本路線最終於2000年6月4日成功投入服務。由於當時上水只有天平總站有空位停泊，總站便設於天平邨。

本路線主要方便屯門東南、屯門市中心及東北的乘客往來北區，最初受到專線小巴44線的競爭，客量只是一般，隨著疊茵庭、彩暉花園、富泰、聚康山莊相繼入伙，需求亦日漸增多，同時亦有很多北區的嶺南大學學生乘搭本路線上下課，而乘搭本路線的屯門居民，大部份是前往北區或過境往來內地，因此繁忙時間兩邊方向都滿載乘客。由於兆康苑居民投訴經常難以登上專線小巴44A線，由2004年2月15日起，本路線來回程繞經兆康西鐵站（南）（現稱兆康站）公共交通交匯處，與專線小巴構成直接競爭。為配合261P線撤出置樂花園，由2011年2月13日起，來回程改經屯興路及青山公路（華都花園／屯門市廣場），不再經杯渡路及屯門鄉事會路（屯門公園）。

本路線開辦以來，在北區的服務範圍僅限上水站、石湖墟及天平一帶。因應粉嶺一帶（尤其聯和墟）的人口增長，同時為加強屯門與北區的公共交通服務，九巴及運輸署於《2018-2019年度巴士路線計劃》中建議本路線延長路線，在上水（天平）後繼續取道馬適路（皇府山）、聯和墟（和睦路、沙頭角公路龍躍頭段）至祥華，擴大服務範圍，令到粉嶺（祥華、聯和墟）居民可以一程車直達屯門區。建議經屯門及北區區議會通過後，於2019年9月30日起實施。是次改動，成為2013年8月24日《北區區域性巴士路線重組》實施，導致原於該處作總站的77K線縮短至上水後，相隔逾六年再次有全日巴士路線進駐該處，並與同樣以祥華為總站，但途經粉嶺南（百和路）、北區醫院至屯門市中心、三聖、黃金海岸及掃管笏的261X線（袛於每日早晚繁忙時間服務），共同肩負粉嶺往返屯門的公共交通服務。為了與輕鐵競爭，由富泰往三聖更設有廉宜的分段收費$4.60，與67M、67X北行線組成屯門東北往返屯門市中心的網絡，比專線小巴46及46A線還要便宜，所以有屯門東北居民及於屯門居住的嶺南大學學生會乘搭本路線往屯門市中心。

本路線前身261R線開辦時，用車以富豪奧林比安11米（AV）為主。2000年提升至全日服務及改稱261後，改派丹尼士巨龍11米（AD）為主力。2006年加入低地台服務，初時以丹尼士三叉戟12米（ATR）為主，其後改為猛獅24.310（AMN）。2012年5月7日起，改派兩部Scania 12米（ASU7／PC3026、ASU22／PC6429）作掛牌，令該款巴士首度服務北區路線。2012年6月28日，本路線的Scania 12米（ASU）全數調往荔枝角車廠，改派兩部歐盟五型富豪B9TL 12米低地台雙層空調巴士（AVBWU244／RH367、AVBWU274／RJ7414），令本路線成為繼270A線後，北區第二條引入此款車型的巴士路線，該款巴士已於2013年全數被調走，MAN 24.310雙層空調巴士（AMN）亦回歸本路線，同時引入Enviro500 MMC 12米（ATENU72／SE6836），為首條引入該車款的北區巴士路線，MAN 24.310雙層空調巴士（AMN）亦被配置Wright Explorer車身的富豪超級奧林比安12米（AVW）取代。2015年10月，本路線全面低地台化，派車主力為Neoplan Centroliner（AP）。

及至Neoplan Centroliner（AP）車隊年事已高行將退役，2016年11月14日起，本路線所有該款巴士被調走，改派Enviro500 12米（ATE）。2017年2月起，該款派車全數換成Enviro500車身富豪B9TL 12米（AVBE），同年屯門車廠（U）重新加入12米MAN 24.310（AMN，已全部退役）取代部分富豪B9TL 12米。2018年初，加入富豪B9TL 12米（AVBWU），同年3月，餘下2輛Volgren車身MAN 24.310被原60X線的2輛低載版富豪B9TL 12米（AVBWU）替代。2019年4月，屯門車廠（U）掛牌全數改派高載版Enviro500 MMC 12米（ATENU）行走。2021年2月，沙田車廠（S）換入Enviro500 MMC 12米（ATENU）。2023年3月，本路線加入富豪B8L 12.8米（V6X）及Enviro500 MMC 12.8米（E6X），為本路線首次加入12.8米巴士作掛牌，令12米掛牌車只剩一輛行走。